kerafast 4014C1-2細(xì)胞系說(shuō)明書 

4B6 / 3598/3442＃2/4011 / 4014C1-2細(xì)胞系

該鼠成纖維細(xì)胞系是4B6 / 3598/3442＃2 / 4011C1細(xì)胞系（目錄號(hào)ESA104）的衍生物，并將mtDNA保持在減少的拷貝數(shù)上。為了產(chǎn)生該細(xì)胞系，將維持mtDNA拷貝數(shù)在正常水平的親代細(xì)胞用質(zhì)粒pMA4014瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，該質(zhì)粒編碼mCherry和FLPo，并針對(duì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行流分選。由于FLPo介導(dǎo)的在細(xì)菌LigA基因前面的MTS切除，導(dǎo)致4B6 / 3598/3442＃2/4011 / 4014C1-2細(xì)胞中線粒體LigA導(dǎo)入效率低下，并且mtDNA保持減少的拷貝數(shù)。該細(xì)胞系及其伴隨的同基因細(xì)胞系4B6 / 3598/3442＃2 / 4011C1（目錄號(hào)ESA104）可用于研究mtDNA拷貝數(shù)對(duì)細(xì)胞生理的影響。

來(lái)自南阿拉巴馬大學(xué)Mikhail F Alexeyev博士的實(shí)驗(yàn)室。

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技術(shù)指標(biāo)

提供者

來(lái)自南阿拉巴馬大學(xué)Mikhail F Alexeyev博士的實(shí)驗(yàn)室。

注釋

將Cre-TM小鼠（JAX 004682，B6.Cg-Tg（CAG-cre / Esr1）5Amc / J）與Lig3LoxP小鼠（Nature 471（2011）240-244）交叉雜交，以提供由肌動(dòng)蛋白驅(qū)動(dòng)的他莫昔芬誘導(dǎo)的Cre表達(dá)啟動(dòng)子。從E13.5胚胎間充質(zhì)制備Lig3Cre-TM小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）。用編碼SV40大T抗原的逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體3315使細(xì)胞永生（J.Biol.Chem.288（2013）26594-26605），并根據(jù)其形成菌落的能力進(jìn)行選擇。選擇了一個(gè)克隆，以其優(yōu)異的生長(zhǎng)特性命名為Cre4。用逆轉(zhuǎn)錄病毒2641（Mol.Biol.Rep.37（2010）1987-1991，其編碼Tet-On Advanced反式激活子，EGFP和殺稻瘟素抗性）轉(zhuǎn)導(dǎo)該克隆，從而產(chǎn)生命名為4B6的克隆。4B6是Cre4的Tet-On衍生物。用逆轉(zhuǎn)錄病毒rv3598（G418抗性）和rv3442（嘌呤霉素抗性）進(jìn)一步轉(zhuǎn)導(dǎo)Cre4，從而通過(guò)Cre介導(dǎo)的切除（rv3442）使細(xì)胞Lig 3基因失活，并重新表達(dá)沒(méi)有線粒體靶向信號(hào)的細(xì)菌LigA基因（ MTS，rv3598）。在不存在限制mtDNA復(fù)制的Lig 3的情況下，LigA的線粒體導(dǎo)入效率低下會(huì)使DNA連接酶活性升高，并導(dǎo)致mtDNA拷貝數(shù)降低。這些細(xì)胞用逆轉(zhuǎn)錄病毒rv4011轉(zhuǎn)導(dǎo)，該病毒編碼與來(lái)自人鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的可激發(fā)的（FLPo）線粒體靶向序列融合的相同LigA。該融合蛋白被有效地導(dǎo)入線粒體，因此在轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中恢復(fù)了正常的mtDNA拷貝數(shù)。后，用編碼mCherry和FLPo的質(zhì)粒4014瞬時(shí)轉(zhuǎn)染得到的細(xì)胞。由于FLPo介導(dǎo)的從LigA去除MTS，因此降低了所得克?。?B6 / 3598/3442＃2/4011 / 4014C1-2中的mtDNA拷貝數(shù)。該細(xì)胞系與同基因細(xì)胞系4B6 / 3598/3442＃2 / 4011C1結(jié)合使用，可用于研究mtDNA拷貝數(shù)對(duì)細(xì)胞生理的影響。

參考文獻(xiàn)

1. Spadafora D，Kozhukhar N，Alexeyev MF。DNA連接酶的不依賴于序列的線粒體導(dǎo)入有助于減少mtDNA拷貝數(shù)的細(xì)胞系的建立。PLoS一。2016三月31; 11（3）：e0152705。